1、免疫组化技术的原理、分类和优点点击次数:3565 发表于:2008-06-15 11:58转载请注明来自丁香园来源:互联网一、免疫组化技术的基本原理应用免疫学及组织化学原理,对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究,这种技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。众所周知,抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性,即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来,以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物,制备特异性抗体,再用这种抗体(第一抗体)作为抗原去免疫动物制备第二抗体,并用某种酶(常用辣根过氧化物酶)或生物素等处理后再与前述抗原成分结合,将抗原放大,由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的,因此,还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来(常用显色剂 DAB 显示为棕黄色颗粒)。通过抗原抗体反应及呈色反应,显示细胞或组织中的化学成分,在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质,如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核
2、酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。二、免疫组织化学染色方法1、按标记物质的种类,如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等,可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。2、按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法);与直接法相比,间接法的灵敏度提高了许多。3、按结合方式可分为抗原抗体结合,如过氧化物酶- 抗过氧化物酶(PAP )法和亲和连接,如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法、链霉菌抗生物素蛋白 -过氧化物酶连结(SP)法等,其中 SP 法是最常用的方法。三、几种常用免疫组织化学方法的原理1、免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理,先将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光,从而可确定组织中某种抗原的定位,进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便,所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后,于
3、 60 年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用,然后加入酶的底物,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,通过光镜或电镜,对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是:定位准确,对比度好,染色标本可长期保存,适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速,已经衍生出了多种标记方法,且随着方法的不断改进和创新,其特异性和灵敏度都在不断提高,使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法、ABC 法、 SP 法等。3、免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶,它能迅速而稳定地吸附蛋白,对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此,用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子( 如葡萄球菌 A 蛋白)等作为探针,就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位,甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒,且胶体金的电子密度高,所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色,因此也适合进行光
4、镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。四、免疫组化技术的优点1、特异性强 免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性,因此,免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示,如角蛋白(keratin)显示上皮成分,LCA 显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。2、敏感性高 在应用免疫组化的起始阶段,由于技术上的限制,只有直接法、间接法等敏感性不高的技术,那时的抗体只能稀释几倍、几十倍;现在由于 ABC 法或 SP 法的出现,使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合,这样高敏感性的抗体抗原反应,使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。3、定位准确、形态与功能相结合 该技术通过抗原抗体反应及呈色反应,可在组织和细胞中进行抗原的准确定位,因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察,这样就可以进行形态与功能相结合的研究,对病理学研究的深入是十分有意义的。免疫组化技术的关键问题汇总(1)点击次数:2786 发表于:2008-06-23 15:02转载请注明来自丁香园来源:互联网一、组织处理恰当的组织处理是做
5、好免疫组化染色的先决条件,也是决定染色成败的内部因素,在组织细胞材料准备的过程中,不仅要求保持组织细胞形态完整,更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫,防止组织自溶。如果出现自溶坏死的组织,抗原已经丢失,即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术,也很难检出所需的抗原,反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压,在上述区域易出现假阳性结果。1、组织及时取材和固定 组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步,是有效防止组织自溶坏死,抗原丢失的开始,离体组织应尽快的进行取材,最好 2h内,取材时所用的刀应锐利,要一刀下去切开组织,不可反复切拉组织,造成组织的挤压,组织块大小要适中,一般在 2.5cm2.5cm0.2cm,切记取材时组织块宁可面积大,千万不能厚的原则,(也就是说组织块的面积可以大到 3cm5cm,但组织块的厚度千万不能超过 0.2cm,否则将不利于组织的均匀固定)。固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。从而完好的保存抗原和组织细胞形态。对于固定液的选择,原则上讲,应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液,但除非是专项科研项目,在病理常规工作很难做到这一点,因为
6、病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE 病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色,而 HE 染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或 4%缓冲多聚甲醛 4 倍于组织体积进行组织固定,利用其渗透性强,对组织的作用均匀进行固定,但组织固定时间最好在 l2h 内,一般固定时间不应超过 24h。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。2、组织脱水、透明、浸蜡 组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。掌握的原则是脱水透明要充分但不能过,浸蜡时间要够,温度不能高,否则造成组织的硬脆使组织切片困难,即使能切片,由于组织的硬脆,也使切片不能完好平整,染色过程中极易脱片,对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利,所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长,正常大小的组织无水酒精脱水 lh3 次,二甲苯透明 lh2 次即可,浸蜡及包埋石蜡温度不要超过 65。二、切片组织得到很好处理后在进行切片之前还应对玻璃片进行处理,由于我们检测抗原是多种多样的,因染色操作程序复杂,时间较长,有些抗原是要进行各种抗原修复处理,如微波、高压、水溶酶等,玻片如果得不到很好的处理,将易造成脱片,为保证免疫组化实验
7、的正常进行,要求在贴片前对载玻片作适当处理,必须在清洗干净的玻片上进行粘合剂的处理以防脱片。1、Poly-L-Lysine (多聚左旋赖氨酸) 一般采用分子量 30000 左右的 0.5%多聚赖氨酸最好,也可用试剂公司出售的其浓溶液以 1:10 去离子水稀释。方法是将玻片浸泡其中,倾尽余液,在 60温箱中烤干备用,此方法的优点是可以用于多种组织化学、免疫组化及分子学检测中的应用,粘贴效果最好,但价格稍贵。2、明胶硫酸铬钾法 将 2.5g 明胶加热溶于 500ml 蒸馏水中,完全溶解冷却后加入0.25g 硫酸铬钾搅匀充分溶解即可使用。方法是将玻片浸泡其中 2min,取出控尽液体入温箱中烤干备用。此法价格便宜、方法简单,任何实验都可以使用,特别适用于大批量的使用,但应注意,如果液体变蓝或粘稠状停用。3、APES (3-氨丙基 -乙氧基甲硅烷) 此法必须现用现配。将洗净玻片入 1:50 丙酮稀释的 APES 中,浸泡 20s,取出稍停再入丙酮或蒸馏水中刷去末结合的 APES 晾干即可。用此方法粘合的玻片应垂直烤片不能平拷,否则组织片中易出现气泡。切片必须保持切片刀锐利,切片要薄而平整、无皱摺
8、、无刀痕,如有上述问题的切片在进行免疫组化染色都将出现假阳性现象,切片厚度一般为 34m,切好的切片在 60温箱中过夜,注意烤片的温度不宜过高,否则易使组织细胞结构破坏,而产生抗原标记定位弥漫现象。6、显色 免疫组化染色的显色是最后的关键问题,一般辣根过氧化物酶(HRP )的检测系统选用 DAB 或 AEC 显色系统进行显色。但要得到最佳的显色效果,必须在镜下严格控制,以检出物达到最强显色而背景无色为最终点,尤其 DAB 显色时间短着色浅,时间长背景又深,都将影响结果判断,根据经验 DAB 在配制完后最长宜放置 30min 以内,过时不能使用,DAB 加到组织切片时作用时间最长不宜超过 10min(最好在 5min 内),否则不管有无阳性都应终止反应。对一些含有内源性酶较高的组织用 DAB 显色时极易出现背景色更应尽早在镜下控制,以达到最佳的分辨效果(棕色)。AEC 显色系统(红色)的弊端是易溶于有机溶剂,所以封片时应以水性封片剂为主,同时染色的切片也不能久存。如果是碱性磷酸酶(AP)最好选用 NBT/BCIP 作为显色系统(结果染为蓝黑色)。7、结果判断 一是对以检测结果阳性细胞指数
9、来定性(如核抗原的标记),判断方法是以一个视野中的阳性细胞数与总细胞的百分比,再取 10 个相同视野算取平均指数;另一种方法以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定,一般阳性细胞数在 025 为阴性,2550 为十,5075 为十十, 75 以上为十十十。此种判定方法容易出现人为误差现象。有条件的实验室最好能用图像分析系统进行结果检测定量分析更为准确。一切的判定方法都是力求使免疫组化染色结果判断更标准,但各单位采取的标准不尽相同,所以判断标准化问题还有待长期实践中病理学术界商讨判定标准。IHC 中常见的抗原表达模式有以下几种:(1)细胞浆内弥漫性分布,多数胞浆型抗体的反应如此,如细胞角蛋白(cytokeratin, CK)和波形蛋白(vimentin)等;(2)细胞核周的胞浆内分布,其判别要点是细胞核的轮廓被勾画得很清楚,如 CD3多克隆抗体的染色;(3)胞浆内局限性点状阳性,如 CDl5 抗体的染色;(4)细胞膜线性阳性,大多数淋巴细胞标记的染色如此,如 CD20、CD45RO;(5)细胞核阳性,如 Ki-67 及雌、孕激素受体蛋白 ER、PR 等。一种抗体可同时出现细胞浆和细胞膜的阳性表达,如 EMA 可呈膜性和胞浆内弥漫性阳性反应;CD30 抗体可同时呈膜性和胞浆内点状阳性反应等。影响免疫组化染色质量的因素有很多,在实验中应注意组织的取材和固定,选择质量好的商品化抗体,恰当地选择和使用封闭和抗原修复手段,严格的技术操作和对照等。假阴性反应可发生在:组织内待测抗原已被分解破坏,或抗原含量过低;抗原被遮盖,多由于醛类固定剂的使用,使组织中的大分子蛋白借醛键形成交联而遮盖待检抗原;抗体质量不佳或稀释度不当;技术操作失误等。假阳性反应可发生在:抗体与非待检抗原发生交叉反应,在使用多克隆抗体时易出现;组织对抗体的非特异性吸附,特别是在有大片组织坏死或组织中有较多富于蛋白的液体时容易发生;内源性过氧化酶的作用,在脾脏、骨髓及一些炎性病变组织的染色中易出现;内源性碱性磷酸酶的作用,特别是肠黏膜上皮和肾近曲小管的刷状缘有高浓度的碱性磷酸酶,若处理不彻底,易出现假阳性结果;判断失误,将肿瘤组织中残留的正常组织的免疫组织化学阳性信号误认为是肿瘤的染色反应;当肿瘤
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